Leonardo da Vinci passou grande parte destes três anos dando atenção integral a esta pintura o que era fato raro para um pintor versátil e do seu quilate.
Sofreu agressões ao longo do tempo desde a abertura de uma porta pelos padres até ao bombardeio aéreo na Segunda Guerra Mundial.
Parcialmente pintada na forma tradicional de um afresco com pigmentos misturados com gema de ovo ao reboco úmido incluindo também um veículo de óleo ou verniz. Da Vinci testou uma nova técnica à solução das tintas com predominância da têmpera, não sendo muito feliz.
Quando Leonardo escolheu esta pintura, que está baseada em João 13:21, no qual Jesus anuncia aos doze apóstolos que alguém, entre eles, o trairia. Esta pintura, na história evangélica, é considerada a mais dramática de todas.
Ao centro, Cristo é representado com os braços abertos, num gesto de resignação tranquila, formando o eixo central da composição. São representadas as figuras dos discípulos num ambiente que, do ponto de vista de perspectiva, é exacto.
Os apóstolos se agrupam em quatro grupos de três, deixando Cristo relativamente isolado ao centro. Da esquerda para a direita (do ponto de vista de quem está diante da pintura), segundo as cabeças, estão no primeiro grupo: Bartolomeu, Tiago Menor e André; no segundo grupo João (cabelo branco inclinado sobre Judas Iscariote, único imberbe do grupo), Judas Iscariote e João; Cristo ao centro; Tomé, Tiago Maior e Filipe (este também imberbe) e no quarto grupo estão Mateus (aparentemente com barba rala), Judas Tadeu e Simão Cananeu também chamado de Simão, o Zelote, por último. Estas identificações provêm de um manuscrito autógrafo de Leonardo encontrado no século XIX
Cogita-se que o rosto de Judas representado na pintura retrataria Girolamo Savonarola, padre Dominicano que governou Florença e que foi executado por ordem do Papa Alexandre VI em 1498.